癫痫患者会突然且不可预测地出现意识障碍，这显著降低生活质量并增加死亡风险。伴有意识障碍的局灶性癫痫是最常见的癫痫类型，约六分之一的病例对目前所有药物和外科疗法均无效。在癫痫发作期间和发作后恢复意识可能会改变这些患者的治疗效果。本研究探讨了深部脑刺激在局灶性边缘系统癫痫大鼠模型中如何改善意识唤醒水平。我们发现，在局灶性边缘系统癫痫发作期间，对丘脑板内侧核（CL）的中央外侧核和脑桥口核（PnO）进行双侧双点刺激，可以恢复正常的皮质电生理功能，并显著改善行为唤醒。相比之下，单独对CL或PnO进行单点双侧刺激不足以达到相同的效果。这些发现支持“网络抑制假说”，即局灶性边缘系统癫痫发作通过广泛抑制皮层下唤醒功能来损害意识。驱动皮层下唤醒功能将成为某些难治性癫痫的一种新治疗方法，并且可能与现有的反应性神经刺激设备兼容。对皮层下唤醒结构进行多部位深部脑刺激，不仅可能有益于癫痫患者，也可能有益于其他意识障碍患者。

一、引言

意识障碍与难治性癫痫发作严重影响了癫痫患者的生产力、安全性和生活质量。此外，发作期间的意识障碍与一种令人痛苦的社会偏见有关，只有通过完全控制发作才能减轻这种偏见，而这对于近四分之一的癫痫患者来说是无法实现的。近年来，神经刺激作为一种治疗难治性癫痫的方法有所发展，但仍有许多患者无法实现完全无发作。对于这些患者，一种旨在改善生活质量、减少发病率和死亡率的策略，尽管发作仍在继续，可能会非常有益。

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意识依赖于多种功能，包括：1）构成意识内容的具体感觉运动系统和其他系统；2）调节整体意识水平的系统，表现为意识、注意力和基本的清醒觉醒。重要的是，清醒觉醒，它区分了昏迷或深度睡眠与清醒状态，可以通过相对简单的行为和生理观察来评估，并且是使其他更高层次的意识发生的关键第一步。在发作间期和发作后颞叶、局灶性边缘发作期间意识丧失的机制已在“网络抑制假说”中被探索并得到整合（图1A）。最近的动物研究和人类数据指出，皮层的功能性去传入是发作期间意识觉醒丧失的核心。在局灶性边缘发作期间，抑制包括上脑干网状结构及其直接靶点内髓核丘脑在内的皮层下觉醒结构，可能导致皮层进入类似深度睡眠或昏迷的状态（图1A）。因此，激活这些皮层下觉醒结构的治疗可能减轻局灶性边缘发作期间经历的意识觉醒丧失（图1B）。

图1. 网络抑制假说及提出的治疗干预。（A）局灶性海马发作引起皮层慢波和意识丧失的示意图。发作活动通过兴奋性投射传播至下丘脑（Hypothal）和侧隔（LS）。这激活了具有抑制性投射的神经元，这些投射指向众多皮层下觉醒结构，包括上脑干的中脑和桥脑网状结构以及内髓核丘脑（Thal）。抑制这些觉醒结构的效果是减少对皮层（额叶皮层以及其他皮层区域）的兴奋性输入，从而使其进入类似睡眠的状态。这种状态在电生理学上以大振幅、低频率的“慢波”为特征。（B）在局灶性海马发作期间，对受抑制的脑干觉醒结构和丘脑进行双位点深部脑刺激（DBS），恢复对皮层的兴奋性输入，恢复清醒样的皮层快活动，改善意识觉醒。

二、材料与方法

2.1 动物

所有程序均获得耶鲁大学机构动物护理与使用委员会的批准。使用成年雌性Sprague-Dawley大鼠，体重200–280 g。

东莞市富临塑胶原料有限公司是AMSystems中国代理商，为中国客户提供电生理产品：记录系统、刺激器、膜片钳、电极、电极丝。

2.2 手术和电极植入

按照之前描述的方法准备局灶性边缘发作的动物模型，并进行以下修改。动物通过肌肉注射80–90 mg/kg的氯胺酮和15 mg/kg的赛拉嗪进行深度麻醉。采用立体定向技术在计划的电极放置位置以及4–5个不锈钢锚定螺钉和一个接地螺钉的位置进行颅骨切开。

为了监测局灶性边缘发作和深部脑刺激期间皮层生理的变化，我们选择记录来自外侧眶额叶皮层（LOFC）的信号。该区域在动物模型和人类研究中均表现出典型的发作间期和发作后慢波活动，以及在广泛皮层区域中出现的功能性神经影像学变化。

所有坐标均以相对于bregma的最终电极尖端位置报告。对于“急性准备”，将一个单极钨微电极植入右外侧眶额叶皮层（LOFC），其阻抗为2–4 MΩ，植入角度为20°，用于记录局部场电位（LFPs）；前-后（AP）+4.2 mm，内-外（ML）-2.2 mm，上-下（SI）-4.2 mm。为了克服刺激诱导的伪影，这种伪影会掩盖多单位数据，我们定制了一个差分记录电极，通过粘合剂将两个单极钨电极连接在一起，使它们的尖端间距小于0.5 mm，并将其以20°的角度植入左外侧眶额叶皮层；AP +4.2, ML +2.2, SI -4.2 mm。这种独特的高阻抗电极近距离配置可以减去大的共享噪声信号，同时保留每个电极尖端附近的独立神经元信号。对于“慢性准备”，将一个不锈钢双绞线双极电极切割至20 mm，电极尖端在冠状面内间距为1 mm，并以20°的角度植入右外侧眶额叶皮层；AP +4.2, ML -2.2, SI -4.2 mm。在急性准备中，为了减轻海马疲劳，在慢性准备中，海马电极在急性准备中是双侧植入的，而在慢性准备中由于空间限制，仅植入单侧电极。双绞线双极电极的尖端在冠状面内间距为1 mm，绝缘层被削去0.5 mm。这些电极被植入背侧海马（HC）；AP -3.8 mm，ML ±3.4 mm，SI -3.6 mm。对于涉及CL（内髓核丘脑）的急性或慢性准备，两个双绞线双极电极被植入双侧CL；AP -2.8 mm，ML ±1.4 mm，SI -5.2 mm。对于涉及PnO（桥脑口核）的急性或慢性准备，两个双绞线双极电极被植入双侧PnO，植入角度为20°；AP -8.0 mm，ML ±1.4 mm，SI -8.0 mm。

在慢性实验中，电极被牢固地用牙科水泥固定在附近的锚定螺钉上。除了接地针外，所有电极针都被小心地弯曲并放入两个6针插头中。接地针被粘合到最尾侧插头的外部，整个装置用硅胶密封剂密封以进行绝缘。皮肤用间断丝线缝合，围绕每个插头进行缝合。慢性记录在术后至少48小时后开始。

2.3 电生理学和视频记录程序

我们在以下条件下进行电生理记录：1）在深度麻醉下进行急性实验，使用80–90 mg/kg的氯胺酮/赛拉嗪进行肌肉注射，导致持续的皮层慢波，期间不触发发作；2）在轻度麻醉下进行急性实验，动物从深度麻醉中恢复到慢波出现频率约为每10秒小于3次的状态；3）在慢性植入、清醒行为动物中进行实验，处于清醒状态、深度麻醉状态、麻醉诱导的睡眠状态（通过肌肉注射低剂量的氯胺酮15 mg/kg和赛拉嗪3 mg/kg），或自然睡眠状态。

CL和/或PnO的刺激由独立的隔离脉冲刺激器（Model 2100, A-M Systems, Sequim, WA, USA）产生。对于所有实验，在深度麻醉下对每只动物进行单侧刺激，以确定产生生理皮层觉醒的有效刺激参数。在急性动物中进行深度麻醉下的刺激以及在慢性植入动物中进行麻醉或睡眠状态下的刺激持续时间为20秒。发作期间的刺激持续时间为120秒。选择该持续时间是为了包括大多数发作（平均发作持续时间为57.9 ± 8.4秒），并且通常包括发作后期的一部分。刺激频率基于先前的研究和未展示的预实验结果，表明大约100 Hz的频率在CL中最为有效，大约50 Hz的频率在PnO中最为有效，以产生皮层生理觉醒。然后根据每只动物单独调整刺激电流幅度。CL最初以100 Hz的频率（每个相位0.5 ms的方波双相脉冲）进行刺激，刺激电流在150至400 µA之间进行调整。急性实验中的最终刺激幅度在双侧刺激时为150至400 µA（每侧约75–200 µA）；在调整过程中测试了更高的安培值，以确保刺激不会引发发作或后放电。PnO在急性实验中以50 Hz的频率（每个相位0.5 ms的方波双相脉冲）进行刺激，调整方法与CL相同（单侧范围为35–200 µA，或双侧为70–400 µA）。对CL和PnO进行假刺激，双侧刺激电流为0.2 µA。

对于慢性实验，在术后至少48小时后进行二次调整，以考虑由于脑内电极尖端的胶质增生导致的电极阻抗变化。在深度麻醉下且无发作的情况下再次进行刺激调整。在所有实验中，双侧刺激的最终范围如下：急性PnO仅70–400 µA；急性CL仅400 µA；慢性PnO仅70–400 µA；双位点CL：150–350 µA，PnO 50–300 µA。对于这些双侧刺激，每侧的电流约为总电流的50%。

在急性实验和慢性实验中，通过单侧海马（HC）的2秒双相方波脉冲（60 Hz，每个相位1 ms）诱导局灶性边缘发作，由WPI线性刺激隔离器产生，电流范围为100 µA至1.5 mA，调整至至少15秒的局灶性海马发作，且无多棘波放电扩散至LOFC。通过键盘输入手动触发刺激，通过Spike2（版本5.2，CED, Cambridge, UK）脚本运行，通过数字-模拟转换器（Power 1401；CED）进行控制。急性实验中的发作是在轻度麻醉状态下诱导的。慢性植入动物中的发作是在清醒状态下诱导的。在一个动物中，发作在肌肉注射0.9 mg/kg的地西泮后15分钟诱导，以防止发作扩散。

在慢性植入动物中，在无发作的低剂量麻醉状态下进行CL和PnO刺激，通过肌肉注射约15 mg/kg的氯胺酮和3 mg/kg的赛拉嗪进行。选择该剂量是为了达到足够的麻醉深度，以产生慢波活动和行为静止状态，而不会加深至手术深度的麻醉。还进行了仅CL、仅PnO和双位点刺激，分别在自然睡眠期间进行。在所有情况下，假刺激（双侧0.2 µA）与真实刺激交替进行。

皮层、HC、CL和PnO信号的记录在微电极放大器（A-M Systems Model 1800）的不同通道上进行。在急性记录中，使用高阻抗FHC电极记录LOFC的局部场电位（LFPs），并通过上述定制的差分记录电极记录多单位活动（MUA）。MUA以1000倍放大增益记录，然后通过数字滤波器进行高通滤波，频率范围为400–10,000 Hz，并增加2.0 dB增益。急性记录中的LFP信号以1000倍放大增益记录，并过滤在1–500 Hz范围内。皮层LFP进一步通过数字滤波器进行100 Hz低通滤波，并增加1.5 dB增益。

在慢性植入动物中，仅使用双极LFP电极进行记录和刺激，将两个6针连接线（PlasticsOne）连接到一个12针换向器（PlasticOne）上。然后将换向器连接到A-M Systems放大器的头部放大器，使用两个定制的6针连接器（363SL-6；PlasticsOne）。将地线单独连接到法拉第笼内的公共地线，该公共地线又连接到建筑地线。HC、CL、PnO和皮层信号在记录放大器上以1–500 Hz的频率进行过滤，并以1000倍的增益进行放大。皮层LFP活动然后通过数字滤波器进行50 Hz低通滤波，并增加1.5 dB增益。

在急性实验和慢性实验中，所有信号都通过模拟-数字转换器进行数字化，使用Spike2（版本5.2；CED）。皮层和HC的LFP以1000 Hz的频率进行采样；皮层MUA以20,000 Hz的频率进行采样。对于慢性记录，电生理学同步的视频通过数字摄像机进行捕获，并使用Spike2 Video Recorder（CED）进行记录。

完成所有电生理记录后，动物通过腹腔注射0.5 mL的戊巴比妥钠和苯妥英钠溶液进行安乐死，以进行电极定位的组织学检查。

2.4 组织学

动物通过心脏灌注0.1%的肝素化磷酸盐缓冲液（PBS），随后是4%的甲醛（PFA）进行固定。大脑被取出并在4°C下用4%的PFA在PBS中后固定至少48小时。大脑在PBS中清洗三次，准备切片，放入2%的琼脂糖凝胶中，并在振动切片机上切成100 µm厚的切片。将切片安装在偏振载玻片上，干燥至少72小时。使用制造商推荐的试剂方案（FD NeuroTechnologies, Columbia, MD, USA）用甲苯蓝对切片进行染色，以确认电极位置。然后用Permount对切片进行封片。在复合显微镜上以40倍的放大倍率拍摄切片图像，使用数字摄像机进行成像，并使用Microsoft Image Composite Editor将图像数字拼接在一起。通过确认电极位置在PnO的特定解剖位置来确认PnO的电极位置，这些位置位于上小脑脚腹侧、旁正中缝核外侧、外侧引带核内侧，以及腹侧被盖区和桥脑网状核的背侧。通过确认电极位置在CL的特定解剖位置来确认CL的电极位置，这些位置位于海马腹侧不超过1.5 mm处，在背侧丘脑内，且位于内侧膝状体/外侧丘脑复合体或内侧膝状体丘脑核的外侧。

2.5 数据分析和统计

数据分析在Spike2（CED）和Microsoft Excel中进行。

分析时间段定义如下：在深度麻醉下的实验中，刺激前时间段定义为刺激前的20秒；刺激内时间段定义为整个20秒的刺激期间；刺激后时间段定义为刺激后的20秒。对于刺激后的时程分析，我们还使用了从刺激后0到60秒的10秒时间段。在所有其他实验中，基线时间段定义为海马刺激前的30秒；发作前刺激时间段定义为海马刺激后至PnO或CL刺激前的时间；发作期间刺激时间段定义为DBS和发作同时发生的时间；发作后刺激时间段定义为发作后、DBS期间的时间；发作后刺激后时间段定义为DBS终止后的30秒。

排除了在分析时间段内出现基于前额皮层LFP中多棘波放电的二次泛化的发作（共13次试验）。对于每个时间段，通过快速傅里叶变换（bin size 1/1.024 Hz，非加窗）确定皮层LFP功率，并将所有试验中的功率归一化至基线时间段内的最大功率。多单位数据首先在Spike2（CED）中通过模板匹配方法进行尖峰排序，以识别每个记录会话中的多达3个单位。为了区分周期性单位放电与更连续的持续放电，生成了自相关图（见图4B中的示例），并在Excel中进一步分析。通过从自相关图中取第一个最小值（最大负相关）和第一个最大值（最大正相关）的平均振幅（绝对值）来量化周期性。在没有周期性放电的时期（通常是基线和发作期间刺激时间段，见图4B），将同一试验中发作前刺激时间段的最大和最小时间应用于其他时间段，以便进行直接比较。使用Spike2（CED）计算每个时间段内的平均放电率。

在慢性植入动物的试验中，使用修改版的量表测量行为觉醒水平，该量表之前在该动物模型中开发和使用过。为每个时间段分配0–4的评分：0表示无探索行为，动物侧卧或睡着；1表示直立/躺卧清醒，腹部接触笼子底部（翻正反射正常）；2表示在笼子底部用前爪进行探索性运动或积极嗅闻笼子底部；3表示用前爪探索笼子的侧面；4表示需要前后肢运动的运动。一个时间段内达到的最高行为评分被分配为该时间段的评分。由两名观察者对所有时间段进行评分，其中一名对时间段身份和刺激（假或真实）条件不知情。评分差异为1分的观察结果被取平均值。在任何时间段的评分中，没有超过1分的评分差异，表明观察者间可靠性相对较好。

在每只动物的实验中，获得了2到9次局灶性边缘发作或刺激。在所有分析中，先对每只动物的数据进行平均，然后再进行组分析，使样本量等于动物数量。这种方法提供了一个更保守的样本量估计；然而，在所有情况下，如果按发作或刺激的总次数进行组分析，结果也是类似的（未显示数据）。数据以组平均值±标准误（SEM）报告。通过双尾Student's t检验评估统计显著性，阈值P = 0.05，并使用Bonferroni–Holm方法对多重比较进行校正。

三、结果

3.1 在深度麻醉下PnO刺激引起的皮层生理觉醒

我们在深度麻醉的动物中对双侧PnO进行电刺激，以确定产生生理皮层觉醒的有效刺激参数，通过增加皮层去同步化和增加皮层持续放电率来衡量。

在深度麻醉期间，皮层LFP中突出且连续的大振幅1–3 Hz慢波在PnO DBS期间和之后被消除（补充图2）。持续的皮层去同步化与通过皮层MUA测量的持续增加的神经元活动相关联（补充图2B，中间和右侧轨迹）。在我们的实验中使用的电流范围内，PnO或海马电极在刺激期间或之后均未测量到后放电或发作样活动。

为了量化低频皮层活动的减少，LFP功率（归一化至动物内最大刺激前功率）在刺激前、刺激期间和刺激后的即刻时间段内进行测量。我们观察到在刺激期间和刺激后低频功率的减少，特别是在δ波段频率（补充图2C；n = 7动物）。这种减少在刺激后持续超过60秒（补充图2D），并且在PnO假DBS（补充图2D；n = 7）或电极位置在目标区域外的动物中未出现（未显示数据；n = 4）。平均δ波段功率（0–4 Hz）在DBS期间显著减少（-73.5 ± 5.1%），与刺激前相比（补充图2E；n = 7；P < 0.0001，Bonferroni–Holm校正）。与刺激前时间段相比，PnO假DBS期间未测量到δ波段功率的显著变化（补充图2E；n = 7；P = 0.58）。

3.2 在局灶性边缘发作期间PnO刺激引起的皮层生理觉醒

最初被麻醉至手术深度的动物被允许恢复到轻度麻醉状态，表现为皮层快速活动在LFP上的占优势，如之前所述。然后通过2秒的海马刺激诱导局灶性边缘发作。在发作开始后约10秒，确定发作没有二次泛化后，再次对双侧PnO进行刺激，刺激电流在70至400 µA之间，按动物调整，或进行0.2 µA的假刺激。在发作期间，发作前PnO DBS之前，我们观察到皮层慢波（图2A,B），之前已知这些慢波在局灶性边缘发作期间和之后出现。PnO DBS在发作期间和发作后消除了皮层慢波（图2A,B）。PnO DBS还与持续增加的皮层活动相关，如持续的MUA增加和从相位放电状态转变为持续放电状态所示（图2A,B）。

图2. 在局灶性边缘发作期间PnO DBS引起的皮层生理觉醒。（A）在轻度麻醉的动物中，PnO DBS在局灶性边缘发作期间减少了外侧眶额叶皮层的慢波。通过2秒、60 Hz的海马（HC）刺激诱导发作。记录中断51秒，期间发作和DBS持续进行，以便显示DBS后的时间段。总DBS持续时间为120秒。（B）标记的基线、发作前刺激、发作期间刺激、发作后刺激和发作后刺激后时间段的5秒放大插图，展示了PnO DBS期间和之后的外侧眶额叶皮层局部场电位（Ctx LFP）的去同步化。外侧眶额叶皮层多单位活动（MUA）从发作前刺激期间的相位放电转变为对DBS的持续放电。PnO刺激后，皮层保持去同步化状态，且无发作后期。

对皮层LFP的组分析显示，在发作期间和发作后PnO刺激期间和之后低频功率减少（图3A,B；n = 9）。这些变化与在无发作的深度麻醉下观察到的变化非常相似（补充图2C）。发作期间DBS时间段内的δ波段功率显著减少，与发作前刺激时间段相比减少了-64.1 ± 5.0%（n = 9；P < 0.001，Bonferroni–Holm校正）（图3B,C）。这与假DBS期间未观察到减少形成对比（n = 7；P = 0.17）。在PnO DBS期间和之后，皮层δ波段功率保持与基线δ功率相似，并且显著低于假刺激的δ波段功率，贯穿所有DBS和刺激后时间段（图3B；PnO DBS n = 9；假控制n = 7；发作期间DBS P < 0.01；发作后DBS P < 0.02；发作后刺激后DBS P < 0.006，Bonferroni–Holm校正）。相比之下，假DBS对照组在发作期间和发作后整个时间段内显示出升高的皮层δ功率（图3B）。尽管DBS显著减少了皮层δ功率，但发作持续时间，以海马记录定义，并未显著改变，DBS时持续72.2 ± 15.4秒，假对照组为83.6 ± 16.9秒（n = 9, 7，分别；P = 0.64）。

图3. 在轻度麻醉下局灶性边缘发作期间PnO DBS的组局部场电位数据。（A）发作前刺激低频功率增加。PnO DBS在发作期间DBS、发作后DBS和发作后刺激后时间段减少了低频功率。黑色箭头表示PnO DBS的开始，白色箭头表示结束。（B）与假刺激相比，每个时间段的δ波段（0–4 Hz）功率的时程。在发作期间DBS、发作后DBS和发作后刺激后时间段，DBS和假条件之间存在显著差异。黑色箭头表示PnO刺激的开始，白色箭头表示结束。（C）发作期间DBS δ波段功率相对于发作前刺激δ波段功率显著减少，与假对照相比。（D）发作后DBS和发作后刺激后DBS δ波段功率相对于基线δ功率在假条件下保持升高，但在DBS条件下恢复到接近基线水平；DBS n = 9，假n = 7动物。所有结果均为平均值±标准误。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，Bonferroni–Holm校正。

在轻度麻醉的急性实验中，我们还研究了PnO刺激对皮层神经元放电的影响，以确认在局灶性边缘发作期间观察到的LFP变化确实代表了增加的皮层觉醒。在发作期间，发作前PnO DBS之前，发作期间的慢波伴随着神经元放电的交替UP和DOWN状态（图2），类似于在深度麻醉和睡眠下观察到的状态。在发作期间和发作后PnO DBS期间，观察到持续的、去同步化的MUA（图2和图4A），类似于之前描述的轻度麻醉或清醒状态下的活动。基线时间段的自相关图显示出去同步化特征（图4B左侧），而发作前刺激时间段的自相关图显示出周期性放电（图4B中间）。PnO DBS与自相关图恢复到去同步化状态相关（图4B右侧）。组分析显示，发作前刺激时间段的第一个周期的平均峰值相关性显著高于基线（n = 8；P < 0.0001）和发作期间DBS（n = 8；P < 0.0001）时间段（P值经Bonferroni–Holm校正；图4C）。PnO DBS有效地将相关性程度降低到基线水平，使得这两个时间段之间没有统计学上的显著差异（n = 8；P = 0.83）。

图4. 在局灶性边缘发作期间PnO刺激期间皮层多单位活动从相位放电转变为持续放电。（A）示例：在轻度麻醉下，通过2秒、60 Hz的海马（HC）刺激诱导局灶性边缘发作，PnO刺激期间的DBS将外侧眶额叶皮层多单位活动（Ctx MUA）在发作前刺激期间观察到的相位UP和DOWN状态恢复到持续去同步化放电。最下方的轨迹（Ctx Spikes）代表尖峰排序的Ctx MUA数据。（B）标记时间段的自相关图显示基线和发作期间DBS时间段的去同步化放电，以及发作前刺激时间段的高度相位放电。（C）组平均第一个周期的峰值相关性显示发作前刺激时间段与基线或发作期间DBS时间段之间存在显著差异。（D）组平均每秒放电次数数据显示，在局灶性边缘发作期间放电率大幅下降，这种下降在DBS情况下得到恢复，而在假情况下则没有。在发作期间DBS和发作后DBS时间段，DBS和假条件之间的放电率变化存在显著差异。对于C和D，所有结果均为平均值±标准误；n = 8动物。与图3相同的动物，除了一个动物没有可用的MUA数据。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，Bonferroni–Holm校正。

从基线的持续放电转变为发作期间的相位放电时，平均放电率也有所下降（图4D，发作前刺激）。PnO DBS将皮层放电率恢复到接近基线水平，在发作期间和发作后DBS时间段，与假刺激相比放电率显著更高（n = 8；发作期间DBS P = 0.005，发作后DBS P = 0.03，Bonferroni–Holm校正；图4D），并且在发作后刺激后时间段也有持续增加放电的趋势（图4D）。

3.3 在清醒动物的局灶性边缘发作期间PnO刺激引起的皮层生理觉醒对行为的改善有限

接下来，我们旨在确定PnO DBS在发作期间和发作后是否能转化为行为觉醒的迹象。在清醒、行为动物中，我们再次使用2秒、60 Hz的海马刺激诱导局灶性边缘发作，伴随着皮层慢波以及行为静止（补充图3A,B）。这些慢波类似于动物自然睡眠或深度氯胺酮/赛拉嗪麻醉下的外侧眶额叶皮层中的慢波。在发作开始后至少5秒，确定发作没有二次泛化后，我们刺激双侧PnO（按动物调整电流；范围70–400 µA）或进行0.2 µA的假刺激。在清醒的慢性植入动物中，PnO DBS期间和之后低频功率的减少类似于急性准备中的效果（补充图3A,B）。组分析显示，在PnO刺激期间和之后低频功率减少（补充图3C），并且在发作期间DBS、发作后DBS和发作后刺激后时间段显著低于假对照组（n = 8；补充图3D）。尽管我们观察到刺激在皮层LFP中消除了发作期间的慢波，但以自发探索行为衡量的行为恢复程度并不显著（n = 8, P = 0.17）。我们注意到，在没有发作的清醒动物中应用类似的PnO DBS刺激幅度（高达400 µA）能够中断运动活动（数据未显示）。因此，我们寻求一种方法，通过降低PnO刺激幅度，同时提供行为益处，来增强PnO DBS产生的皮层生理觉醒。

3.4 双位点CL和PnO刺激改善了局灶性边缘发作期间的皮层生理觉醒

由于先前的研究表明CL在调节局灶性边缘发作和继发性全身发作后的觉醒中起着重要作用，我们决定刺激这一区域。单独在CL进行400 µA的刺激在发作期间并未显著减少皮层慢波（补充图4）。然而，通过双位点CL和PnO刺激，我们能够将PnO刺激电流减少47%（PnO单独刺激的平均电流为150 ± 25 µA，而双位点刺激为79 ± 9 µA；P = 0.01），同时在发作期间和发作后有力地消除了慢波（图5）。

图5. 双位点CL + PnO刺激在清醒、行为动物的局灶性边缘发作期间产生皮层生理觉醒。（A）在清醒、行为动物的局灶性边缘发作期间，联合内髓核丘脑和桥脑口核的DBS减少了外侧眶额叶皮层局部场电位（Ctx LFP）中的慢波。通过2秒、60 Hz的海马（HC）刺激诱导发作。记录中断90秒，期间发作和DBS持续进行，以便显示DBS后的时间段。总DBS持续时间为120秒。（B）标记的基线、发作前刺激、发作期间刺激、发作后刺激和发作后刺激后时间段的5秒放大插图，展示了双位点刺激期间的去同步化Ctx LFP。刺激停止后，尽管发作仍在继续（此例中的发作持续时间长于DBS），但慢波返回，发作后，Ctx LFP恢复到去同步化状态。

在组分析中，双位点CL和PnO DBS的效果类似于单独刺激PnO的效果，显著减少了清醒、行为动物在发作期间和发作后的皮层慢波（图6A,B）。发作期间DBS时间段内的δ波段功率显著减少，与发作前刺激时间段相比减少了-87.59 ± 0.87%（n = 6；P < 0.0001，Bonferroni–Holm校正），并且与假DBS相比也有显著差异（图6B,C）。发作后皮层慢波在假对照组中保持升高，但在双位点DBS中显著减少，将皮层活动恢复到接近基线水平（图6B,D）。值得注意的是，DBS组（52.6 ± 13.5秒；n = 6）和假对照组（44.8 ± 8.9秒；n = 7；P = 0.63）之间的发作持续时间没有显著差异。

图6. 在清醒、行为动物的局灶性边缘发作期间双位点CL和PnO刺激的组数据。（A）双位点CL + PnO DBS在清醒状态下诱导的局灶性边缘发作期间和之后减少了低频功率。黑色箭头表示PnO DBS的开始，白色箭头表示终止。（B）与假刺激相比，每个时间段的δ波段（0–4 Hz）功率的时程。在发作期间DBS和发作后DBS时间段，DBS和假条件之间存在显著差异。黑色箭头表示PnO DBS的开始，白色箭头表示结束。（C）发作期间DBS δ波段功率相对于发作前刺激δ波段功率显著减少，与假刺激相比。（D）发作后DBS δ波段功率相对于基线δ波段功率在假情况下保持升高，而在刺激情况下恢复到接近基线水平。所有结果均为平均值±标准误；n = 6动物。*P < 0.05，**P < 0.01，Bonferroni–Holm校正。

我们注意到，在没有发作的双位点刺激期间，在麻醉状态下以及自然睡眠状态下，也观察到类似的皮层慢波减少（数据未显示）。

3.5 双位点CL和PnO刺激显著改善了局灶性边缘发作期间的行为觉醒

局灶性边缘发作的特征是行为静止，并伴有轻微的自动症，如之前所述。然而，在清醒动物的局灶性边缘发作期间进行双位点双侧DBS时，我们观察到正常探索行为显著增加（图7A；另见补充视频1）。评分由两名观察者进行，观察者间可靠性高（κ = 0.97）。双位点CL + PnO DBS恢复了正常的皮层功能，并使动物能够在持续的海马发作活动期间表现出正常的清醒行为，包括放松的前肢和后肢运动以及探索笼子的侧面（补充视频1）。与假DBS相比，发作期间的正常探索行为显著增加（n = 6；P < 0.0001，Bonferroni–Holm校正），并且与发作前基线没有显著差异。值得注意的是，双位点DBS在发作后期并不干扰正常的探索行为（图7A），并且在非发作期间也不干扰正常行为（数据未显示）。

图7. 在局灶性边缘发作、麻醉诱导睡眠和自然睡眠期间双位点CL + PnO DBS的行为觉醒。（A）与假刺激相比，CL + PnO DBS在局灶性边缘发作期间显著增加了自发探索行为；n = 6动物。（B）在低剂量麻醉诱导睡眠期间，CL + PnO DBS在刺激期间和刺激后时间段显著增加了自发探索行为；n = 6动物。（C）在自然睡眠期间，CL + PnO刺激在刺激期间和刺激后时间段显著增加了自发探索行为；n = 6动物（与图6相同的动物）。所有数据（A–C）均以平均值±标准误表示。**P < 0.01，***P < 0.001，Bonferroni–Holm校正。

除了发作期间的行为静止外，我们还经常观察到发作后的“湿狗抖动”，这种现象之前已在啮齿动物的局灶性边缘发作中描述过，并伴有EEG上的短暂多棘波放电。双位点CL + PnO DBS显著减少了发作后湿狗抖动的频率，仅在11.7%的试验中出现，而假DBS对照组为91.7%（n = 6动物，P < 0.0001）（补充视频1）。

为了进行比较，我们还在局灶性边缘发作之外的其他皮层慢波和低觉醒状态（包括麻醉诱导睡眠和自然睡眠）中研究了双位点CL + PnO DBS的效果。我们发现，与假DBS相比，双位点DBS在麻醉期间（n = 6；刺激期间P < 0.01；刺激后P < 0.0001，Bonferroni–Holm校正；图7B）和自然睡眠期间（n = 6；刺激期间P < 0.01；刺激后P < 0.0001，Bonferroni–Holm校正；图7C）显著增加了探索活动评分。动物在探索行为期间表现出显著减少的慢波活动，显示出向清醒状态的生理转变，然后最终返回睡眠或再次进入麻醉状态（数据未显示）。

四、讨论

我们发现，通过在丘脑和桥脑上刺激皮层下觉醒，可以逆转局灶性边缘发作对意识觉醒的不利影响，增加发作期间和发作后的皮层生理觉醒和行为反应性。单独刺激PnO在深度麻醉下恢复了清醒样的皮层状态，无论是在刺激期间还是在发作期间和发作后。然而，在清醒、行为动物中进行相同的PnO刺激虽然产生了类似的电生理学结果，但并未显示出行为改善的证据。单独刺激内髓核丘脑（CL）在深度麻醉下和发作后产生了皮层生理觉醒（Gummadavelli等人2015），但在发作期间无法防止皮层慢波。通过联合刺激这两个靶点，我们实现了双位点CL + PnO刺激，在局灶性边缘发作期间既产生了电生理学改善，又产生了行为改善。据我们所知，这些结果是首次在临床前研究中显示深部脑刺激改善发作期间意识觉醒水平的数据。

这里报告的结果支持了一个模型，即在局灶性边缘发作期间，一系列和/或并行的皮层下觉醒系统受到抑制（图1A）。通过多部位刺激恢复这些系统的觉醒功能，比在单一网络节点进行刺激对皮层回路产生更强的协同效应（图1B）。这种多部位刺激皮层下觉醒的策略不仅可能使癫痫患者受益，还可能使其他意识障碍患者受益，包括创伤性脑损伤、中风或其他慢性意识水平降低的状态。

本研究中刺激的具体部位是皮层下觉醒的关键节点；然而，未来的研究可以考虑其他靶点（Gummadavelli等人2015）。桥脑网状结构，特别是PnO，已被认为与自发活动、快速眼动睡眠和觉醒的调节有关，但关于其作用有时存在不同的结论。早期研究表明桥脑网状结构在自发活动中没有作用，而一些最近的证据表明它确实对行为状态和皮层慢波调节有贡献。多项药物灌注研究巩固了其作为睡眠调节区域的作用。最近的研究表明，PnO的刺激可在轻度麻醉的大鼠中诱导皮层去同步化，并增加与基底前脑-边缘系统结构（如Meynert核基底）的功能连接。

同样，内髓核丘脑也被认为与睡眠-觉醒状态、麻醉、意识水平和注意力的调节有关。在患有慢性创伤后脑病且处于最小意识状态的患者中，CL的刺激产生了依赖刺激的觉醒，并改善了包括觉醒在内的功能结果。我们小组之前的研究表明，CL的刺激可在麻醉下诱导皮层去同步化，并在自由行为动物的发作后期间改善觉醒（Gummadavelli等人2015）。在这里，我们证明了单独刺激CL在局灶性边缘发作期间无法产生皮层去同步化，并且认为这反映了发作期间比发作后更广泛的多通路抑制了皮层下觉醒。当对比单部位与双部位刺激的效果时，进一步的证据表明存在多个复杂的重叠觉醒通路；与单独刺激每个部位相比，双部位刺激时的皮层去同步化更为显著，并且在两个部位所需的刺激幅度都更低。由于单独刺激任何一个部位都不足以产生效果，但联合刺激两个部位是必要的，以产生恢复意识觉醒的电生理学和行为相关性，这支持了存在多个复杂重叠的觉醒通路的观点，这些通路根据激活的节点组合以及它们活跃的状态，对意识产生不同的影响。在先前的研究和快速发展的反应性神经刺激及DBS技术的背景下，我们的结果提供了一种解决难治性局灶性癫痫发作期间意识丧失的新策略，并对其他意识障碍有明确的启示。

未来的研究需要探索最佳的刺激范式和参数。例如，未来的调查可能包括在发作发作之前或发作发作的同时进行刺激，这在本研究中没有进行，以允许在治疗刺激传递之前评估二次泛化。本研究特别调查了没有泛化的局灶性边缘发作，尽管在先前的研究中，我们在继发性全身发作后的发作后期间通过刺激CL发现对觉醒有益的效果。在没有泛化的局灶性边缘发作中，我们也发现在发作后期间对皮层生理觉醒有益的效果，尽管我们没有观察到显著的发作后缺陷。因此，无法在发作后期间观察到行为益处。使用更详细的带有刺激/反应范式的行为测试的进一步研究，可能使我们能够更细致地了解DBS在发作期间和发作后期间提供的任何认知改善。其他刺激参数，如频率、脉冲宽度、幅度、持续时间以及刺激模式（例如，间歇性与连续性）也需要进一步调查。此外，尽管本研究中使用的刺激频率范围部分掩盖了γ波段活动，但在未来的研究中，研究高频γ波段皮层活动的变化作为皮层激活的额外标志物可能是有趣的。特别值得注意的是，最近的数据表明，在局灶性边缘发作期间，通过光遗传学激活大鼠脑干胆碱能神经元可改善皮层生理觉醒。此外，光遗传学激活GABA能和甘氨酸能轴突纤维从桥脑网状结构出发已被证明可导致内髓核丘脑抑制，从而在自由活动的小鼠中引起行为静止并中断清醒样皮层活动，进一步巩固了亚皮层相互作用在觉醒调节中的作用。虽然光遗传学的机制提供了对特定神经元对网络功能贡献的优雅解剖，但电刺激的复杂且可能非特异性的机制阻止了我们充分识别哪些神经元群体被激活或去激活。此外，可能来自其他皮层下觉醒系统的en passant纤维肯定以未知的、可能有贡献的方式受到影响。另一方面，电刺激的相对广泛且可能强大的效应，作为一种已被广泛临床使用的神经调节模式，显然允许快速的临床转化，特别是当与当前的反应性神经刺激范式结合时。

关于替代靶点，其他皮层下觉醒结构已在睡眠、麻醉、帕金森病和其他障碍的背景下进行了研究，并显示出对觉醒水平的不同影响。尽管在人类中植入了非常接近PnO的皮下靶点的治疗电极，如脚桥核，但皮上靶点可能提供较低的手术风险特征。值得注意的是，基底核是皮上区域，位于PnO的上行投射通路中，并且与新皮层有广泛的胆碱能和非胆碱能觉醒连接，使其成为未来刺激的有希望的潜在靶点。

发作期间意识丧失造成的损害是与癫痫相关的发病率和死亡率的主要贡献因素。发作期间意识丧失的机制也涉及导致癫痫猝死的心肺功能障碍。此外，意识丧失导致的生产力下降、生活质量下降和社会偏见强调了其作为一个值得解决的临床属性。目前，对前核丘脑的持续DBS以及基于NeuroPace的对发作源的反应性神经调节都专注于减少发作频率。对于缺乏完全发作控制的患者，即患有药物和手术难治性癫痫的患者、癫痫灶位于功能区的患者或存在禁忌症而无法进行大范围切除手术的患者，通过DBS改善发作期间的意识水平可能会显著改善他们的生活质量以及整体死亡风险。目前在相同或非常接近这里讨论的脑区进行的立体定向手术已被证明在其他神经障碍中是安全有效的。我们预计这些临床前结果将为将这些临床前数据快速转化为改善癫痫患者生活质量的新治疗策略奠定基础。

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